中藥益腎平肝方對(duì)脫髓鞘模型小鼠社會(huì)交互行為的影響及作用靶點(diǎn)

【摘要】 目的 觀察中藥益腎平肝方對(duì)精神分裂癥的治療效果以及探究其作用的潛在靶標(biāo)。方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用成年雄性

C57BL/6 小鼠，6 周齡，實(shí)驗(yàn)分為 3 組，每組 10 只: 對(duì)照組，cuprizone( CPZ) 模型組和益腎平肝方( Yishenpingganfang，YSPGF) 治療組，實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行 6 周。社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)以及組織采集在后一次給予中藥治療 24h 后進(jìn)行。采用社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)以評(píng)價(jià) YSPGF 對(duì)小鼠精神分裂癥樣行為的影響; 采用髓鞘特異性免疫組化和 Western blotting 觀察成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞的表達(dá)變化。結(jié)果 CPZ 模型組小鼠于第 3 周出現(xiàn)明顯體質(zhì)量下降( P ＜ 0. 05) ，YSPGF 治療組與 CPZ 模型組相比，體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0. 05) ; 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn): Trial 1 實(shí)驗(yàn)中: 對(duì)照組小鼠圍繞陌生小鼠 1 ( Stranger 1) 的時(shí)間明顯大于圍繞空杯子( Empty) 的時(shí)間( P ＜ 0. 001) 。YSPGF 組與對(duì)照組類似，圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 01) 。但模型組小鼠圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時(shí)間之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0. 05) 。Trial 2 實(shí)驗(yàn)中: 對(duì)照組小鼠對(duì)新加入的 Stranger 2 較之已經(jīng)熟悉的 Stranger 1 更加感興趣( P ＜ 0. 001) 第; 成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體髓鞘堿性蛋白 ( myelin basic protein，MBP) 免疫組織化學(xué)染色和 Western blotting 顯示: CPZ 模型組小鼠成熟膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘在胼胝體有一定程度缺失，YSPGF 組與 CPZ 模型組相比，髓鞘脫失有所好轉(zhuǎn)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示: 少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞血小板源生長(zhǎng)因子受體 α( platelet-derived growth factor receptoralpha，PDGFＲ-α) 在 CPZ 誘導(dǎo)脫髓鞘后有反應(yīng)性增生。結(jié)論 中藥 YSPGF 可以改善 CPZ 誘導(dǎo)小鼠的社會(huì)退縮，改善少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘結(jié)構(gòu)的損害。

【關(guān)鍵詞】 精神分裂癥; 益腎平肝方; 少突膠質(zhì)細(xì)胞; 雙環(huán)己酮草酰二腙; 社會(huì)交互

精神分裂癥是一種病因尚未*闡明的復(fù)雜性的精神疾病，人口受累率達(dá)到 0. 5% ～ 1. 0%［1］，是導(dǎo)致殘疾的十種主要疾病之一，給家庭和社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［2］。精神分裂癥發(fā)病有多種假說，包括多巴胺 D2 受體亢進(jìn)假說及神經(jīng)發(fā)育異常假說［3］。目前抗精神病藥物主要是基于多巴胺 D2 受體作為靶點(diǎn)發(fā)揮臨床治療效果，但是仍然有一部分患者無法臨床*，因此從神經(jīng)保護(hù)角度開發(fā)新的抗精神病藥物是精神藥物研究的重要方向之一［4］。益腎平肝方( Yishenpingganfang，YSPGF) ［5］ 是首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合團(tuán)隊(duì)用于治療精神分裂癥前驅(qū)期的一個(gè)有效經(jīng)驗(yàn)方，其臨床研究結(jié)果表明，該中藥方劑對(duì)精神分裂癥前驅(qū)期的癥狀和認(rèn)知損害有改善作用。它的主要成分有菊花、山茱萸、防風(fēng)、何首烏等。從山茱萸［6］和何首烏［7］中提取的活性成分對(duì)神經(jīng)有保護(hù)作用。cuprizone 模型［8］( CPZ 模型) 是基于神經(jīng)發(fā)育假說的一種能夠誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞丟失和脫髓鞘的精神分裂癥樣模型［9］。為此，本研究采用 CPZ 模型研究中藥益腎平肝方的藥理學(xué)作用機(jī)制［10］。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6 周齡的雄性 C57BL /6 小鼠，共 30 只，體質(zhì)量( 20 ± 2) g。所有小鼠均由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào): SCXK( 京) 2016 － 0011。實(shí)驗(yàn)環(huán)境清潔，晝夜交替 12 h，正常飲食飼養(yǎng) 1 周以適應(yīng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)通過首都醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)( 倫理批號(hào): AEEI-2018 － 047) 。

1. 2 主要藥品及試劑

雙環(huán)己酮草酰二腙( cuprizone，CPZ) 和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性抗體髓鞘堿性蛋白抗體 ( Anti-MyelinBasic Protein，MBP 抗體) 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司; 少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞血小板源生長(zhǎng)因子受體 α( plateletderived growth factor receptor-alpha，PDGFＲ-α) 抗體( PDGFＲ-α 抗 體，APA5 ) 購(gòu) 自 美 國(guó) Abcam 公 司。YSPGF 的各種單藥飲片購(gòu)自北京同仁堂 ( 大柵欄店) ，在首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院熬制成浸膏。兔二步法檢測(cè)試劑盒和 DAB 顯示試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1. 3 主要儀器

社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)( 40 cm × 60 cm × 20 cm，由3 個(gè)連在一起的箱子構(gòu)成，廂壁由透明有機(jī)玻璃制成) 購(gòu)自上海欣軟信息科技有限公司。

1. 4 實(shí)驗(yàn)方法

1. 4. 1 動(dòng)物分組及處理適應(yīng) 1 周后，將小鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為 3組，每組 10 只: 對(duì)照組，CPZ 模型組［CPZ + 0. 9% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射液］，YSPGF 組( CPZ + YSPGF，YSPGF 的給藥劑量 3. 54 g·kg － 1·d － 1 ) 。對(duì)照組正常飲食，模型組和 YSPGF 組食用混合了 0. 2 % ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) CPZ 的特殊飼料，每日給予。建模 4 周后，模型組以 0. 9% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 氯化鈉注射灌胃 2 周，YSPGF組給予中藥 YSPGF( 3. 54 g·kg － 1·d － 1 ) 灌胃 2 周。每周測(cè)量 1 次小鼠體質(zhì)量。

1. 4. 2 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)

用來評(píng)定小鼠社會(huì)交往能力和對(duì)新事物的探索能力。提前將小鼠搬入測(cè)試室，使小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)裝置5 min，每天 1 次，連續(xù) 3 d。試驗(yàn)當(dāng)天，在試驗(yàn) 1( Trial 1) 中，被試小鼠被放置在中間的箱子中，并被允許在3 個(gè)箱室中探索 10 min。一只陌生的老鼠被關(guān)在鐵絲籠子里，被放在一邊的箱子里，另一邊的箱子里放著一個(gè)空籠子。在試驗(yàn) 2( Trial 2) 中，一只新的不熟悉的老鼠被放在之前放空籠子的箱子里中。記錄時(shí)間均為 10 min。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束用稀釋的乙醇*清潔箱籠。實(shí)驗(yàn)中所需的兩只陌生小鼠需要與待測(cè)的小鼠品系、年齡、性別以及體質(zhì)量相匹配，并且該小鼠與待測(cè)小鼠不能同籠飼養(yǎng)過。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，需使用相同的兩只陌生小鼠。測(cè)試過程采用視頻記錄儀( 上海欣軟信息科技有限公司) 記錄并分析。

1. 4. 3 固定標(biāo)本與取材

在完成行為學(xué)測(cè)試后，5 只小鼠經(jīng) 4% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 水合氯醛腹腔麻醉，然后進(jìn)行心臟灌注，先灌注30 mL 0. 9% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 的氯化鈉注射液至肺臟和肝臟的顏色變?yōu)榛野祝又嘧?50 mL 4% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液，待小鼠四肢抽搐結(jié)束，僵硬即可。取出小鼠大腦，用 4% ( 質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 多聚甲醛溶液固定，用于免疫組化染色研究。使用兔二步法和 DAB 染色法進(jìn)行染色。5 只小鼠經(jīng)頸部脫臼處死，迅速取出大腦移至 － 80 ℃保存，用于 Western blotting 分析。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用 Graph Pad 軟件( Prism 5 版本) 。對(duì) 3 組小鼠在社會(huì)互動(dòng)實(shí)驗(yàn)中與陌生鼠的接觸時(shí)間( s) 進(jìn)行 t 檢驗(yàn)，以 P ＜ 0． 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 YSPGF 對(duì)小鼠體質(zhì)量及小鼠胼胝體髓鞘堿性蛋白( myelin basic protein，MBP) 表達(dá)的影響前 2 周，3 組小鼠體質(zhì)量變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但從第 3 周開始，模型組小鼠體質(zhì)量明顯減低( P ＜0. 05) 。第 4 周體質(zhì)量略微增加。模型組小鼠體質(zhì)量變化與 YSPGF 組小鼠相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞0. 05) ( 圖 1A) 。免疫組化分析結(jié)果( 圖 1B) 顯示，模型組小鼠胼胝體 MBP 表達(dá)明顯下降，說明本研究CPZ 模型的建立是成功的。給予 YSPGF 處理后該組小鼠 MBP 表達(dá)有一定提高，提示 YSPGF 對(duì)白質(zhì)損傷具有保護(hù)作用。

2. 2 YSPGF 對(duì) CPZ 小鼠社會(huì)交互的影響

Trial 1 實(shí) 驗(yàn) 中: 對(duì) 照 組 小 鼠 圍 繞 陌 生 小 鼠 1( Stranger 1) 的時(shí)間明顯大于圍繞空杯子( Empty)的時(shí)間( P ＜ 0. 001 ) 。YSPGF 組與對(duì)照組類似，圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＜ 0. 01 ) 。但 模 型 組 小 鼠 圍 繞 Stranger 1 與Empty 的時(shí)間之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0. 05 )( 圖 2A) 。Trial 2 實(shí)驗(yàn)中: 對(duì)照組小鼠對(duì)新加入的 Stranger 2 較之已經(jīng)熟悉的 Stranger 1 更加感興趣( P ＜0. 001) ，與 對(duì) 照 組 不 同，模 型 組 小 鼠 并 沒 有 對(duì)Stranger 2 表現(xiàn)出好奇，表明其社會(huì)動(dòng)力以及對(duì)新奇事物的探索能力下降; YSPGF 組小鼠與新的陌生小鼠 接 觸 時(shí) 間 與 模 型 組 相 比，明 顯 增 多，表 明YSPGF 對(duì) CPZ 小鼠的社會(huì)交往能力以及對(duì)新生事物的探索能力均有改善( 圖 2B) 。

2. 3 YSPGF 對(duì)小鼠海馬 PDGFＲ-α 表達(dá)的影響

Western blotting 結(jié)果( 圖3) 顯示，PDGFＲ-α 經(jīng) CPZ誘導(dǎo)脫髓鞘后有反應(yīng)性增生，給予 YSPGF 進(jìn)行干預(yù)后，PDGFＲ-α 的代償性增生與模型組相比，呈減少趨勢(shì)，表明 YSPGF 對(duì)小鼠的少突膠質(zhì)細(xì)胞損害有所改善。

3 討論

越來越多的證據(jù)［11-13］顯示，精神分裂癥中少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘存在異常，其證據(jù)主要來源于影像學(xué)研究［11］、尸檢［12］以及基因?qū)W研究［13］。CPZ［14］是一種銅離子的螯合劑，第yi次對(duì) CPZ 的描述可追溯到 1950年 Gustav Nilsson 的實(shí)驗(yàn)［15-16］。研究［17］顯示: CPZ 選擇性損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞。給予不同時(shí)間的 CPZ 處理會(huì)誘導(dǎo)出不同的行為學(xué)改變。例如，給予小鼠 2 ～ 3周 CPZ 處理，小鼠會(huì)出現(xiàn)更多的攀爬行為，如果給予4 ～ 6 周 CPZ，則表現(xiàn)為社會(huì)功能退縮。本實(shí)驗(yàn)中，在給予小鼠 4 周 CPZ 后，免疫組化結(jié)果顯示，CPZ 小鼠在 4 周后少突膠質(zhì)細(xì)胞大面積凋亡，說明筆者的 CPZ小鼠模型是成功的。在本實(shí)驗(yàn)中，筆者采用 CPZ 誘導(dǎo)精神分裂癥樣動(dòng)物行為，采用中藥 YSPGF 對(duì) CPZ 小鼠進(jìn)行治療。本研究社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示; 第yi輪實(shí)驗(yàn)( Trial 1)中，對(duì)照組小鼠圍繞陌生小鼠 1 ( Stranger 1) 的時(shí)間明顯大于圍繞空杯子( Empty) 的時(shí)間，YSPGF 組與對(duì)照組類似，圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但模型組小鼠圍繞 Stranger 1 與 Empty 的時(shí)間之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第二輪實(shí)驗(yàn) ( Trial 2) 中，對(duì)照組小鼠對(duì)新加入的 Stranger 2 較之已經(jīng)熟悉的Stranger 1 更加感興趣，與對(duì)照組不同，模型組小鼠并沒有對(duì) Stranger 2 表現(xiàn)出好奇，表明其社會(huì)動(dòng)力以及對(duì)新奇事物的探索能力下降; YSPGF 組社會(huì)互動(dòng)行為較模型組有一定的改善; 社會(huì)交互實(shí)驗(yàn)主要反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的社會(huì)交往能力和對(duì)新事物的探索能力，在一定程度上模擬了精神分裂癥的陰性癥狀( 意志行為活動(dòng)缺乏和情感平淡) ，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予 YSPGF 進(jìn)行干預(yù)，CPZ 小鼠的社會(huì)交往能力和探索能力有所改善，提示 YSPGF 對(duì)精神分裂癥的陰性癥狀有一定的改善作用。本研究免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠胼胝體MBP 表達(dá)明顯下降，Western blotting 結(jié)果顯示，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞 PDGFＲ-α 在 CPZ 誘導(dǎo)脫髓鞘后有反應(yīng)性增生，說明經(jīng) CPZ 處理后小鼠少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘有一定程度的受損。而經(jīng) YSPGF 干預(yù)后，MBP表達(dá)增多和 PDGFＲ-α 減少，說明中藥方劑對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞/髓鞘的受損有一定改善作用，也提示了該處方有一定神經(jīng)保護(hù)作用，也部分解釋了 YSPGF 改善CPZ 小鼠社會(huì)交互受損的藥理學(xué)機(jī)制。YSPGF 中的山茱萸、何首烏含有神經(jīng)保護(hù)作用的成分。多項(xiàng)研究［18-19］表明山茱萸中的山茱萸環(huán)烯醚萜苷［6］( cornel iridoid glycoside，CIG) 能改善局灶性腦缺血大鼠模型的神經(jīng)功能缺損，抑制腦組織炎性反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡，促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生和血管新生; 并且可改善穹窿 － 海馬傘切斷模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，增高腦組織神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量和神經(jīng)元存活［20］。何首烏中提取的主要活性成分———四羥芪葡萄糖苷 ( tetrahydroxystilbene glucoside，TSG) 具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，可以改善動(dòng)物的記憶能力。這些研究結(jié)果間接支持了本研究所發(fā)現(xiàn)的 YSPGF 的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究只是用社會(huì)交互行為模型探討了 YSPGF對(duì)精神分裂癥的陰性癥狀的改善作用，今后應(yīng)該增加其他行為模型觀察該方對(duì)精神分裂癥的多維治療效果，如用 Y 迷宮觀察該方對(duì) CPZ 小鼠的工作記憶受損是否有改善作用，用 PPI 觀察該方對(duì) CPZ 小鼠的感覺門控受損是否有改善作用。本研究只是從 MBP 和PDGFＲ-α 的表達(dá)探討了 YSPGF 的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，今后應(yīng)該從 NＲG1-ErBb4 信號(hào)通路以及氧化應(yīng)激通路更進(jìn)一步探討該方的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究只是用小樣本動(dòng)物進(jìn)行了單一行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，今后應(yīng)該根據(jù)行為學(xué)的增多和作用機(jī)制的深度探討擴(kuò)大樣本量。