阻燃劑TCPP暴露對(duì)小鼠的神經(jīng)毒理作用觀(guān)察及相關(guān)機(jī)制研究

【摘要】目的探討阻燃劑TCPP (tris(2~chloroisopropyl) phosphate)暴露對(duì)小鼠的神經(jīng)毒理作用觀(guān)察及相關(guān) 機(jī)制研究。方法將30只成年KM小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（0 mgKkg，d))、低劑量（TCPP)組（10 mgKkg，d))

和高劑量TCPP組（100 mg^kg*d)),持續(xù)灌胃染毒30 d。染毒結(jié)束后，觀(guān)察其體質(zhì)量及一般情況。采用水迷宮實(shí) 驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定小鼠血清總?cè)饧紫僭彼?/span>（TT3)、游離三碘甲腺原氨 酸（FT3)、總四碘甲腺原氨酸（TT4)和游離四碘甲腺原氨酸（FT4)水平；采用比色法測(cè)定小鼠腦組織中谷胱甘肽轉(zhuǎn) 移酶（GST)和超氣化物歧化酶（SOD)、丙二醛（MDA)、過(guò)氣化氫酶（CAT)水平。結(jié)果與對(duì)照組小鼠相比,TCPP 高劑量組小鼠飲水量顯著下降（P< 0. 05),肝和脾臟器指數(shù)明顯升高（P< 0. 05)。TCPP暴露組小鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn) 中逃避潛伏期均較正常組小鼠出現(xiàn)延長(zhǎng)（P< 0. 05),高劑量組小鼠游泳總路程出現(xiàn)明顯升高（P< 0. 05),同時(shí)在目 標(biāo)象限停留時(shí)間也明顯縮短（P< 0. 05)。高劑量TCPP染毒組小鼠與對(duì)照組小鼠相比TT3、FT3出現(xiàn)明顯增高（P<

0. 05)。與對(duì)照組小鼠相比，高劑量TCPP染毒組小鼠GST、OD出現(xiàn)明顯降低，MDA顯著增高（P< 0. 05)。與對(duì)照 組小鼠相比,低劑量TCPP染毒組小鼠僅GST出現(xiàn)降低,MDA增高（P< 0.05)。結(jié)論TCPP暴露具有明顯的神經(jīng) 毒性作用，能造成小鼠學(xué)習(xí)記憶能力喪失，其毒性機(jī)制可能與腦組織氣化損傷及甲狀腺激素增高有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】TCPP;學(xué)習(xí)記憶；甲狀腺激素;氣化損傷;小鼠

有機(jī)磷阻燃劑（organophosphate flame retardants, OPFRs)是一種化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，并能在環(huán) 境中長(zhǎng)期存在的新型阻燃劑。空氣、水體中的 OPFRs會(huì)通過(guò)呼吸道、消化道進(jìn)入生物體內(nèi)¹⁰。隨 著多漠聯(lián)苯釀（polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)類(lèi)阻燃劑的禁用，OPFRs的使用量與日俱 增。有研究顯示，多種環(huán)境介質(zhì)及生物體內(nèi)OPFRs 檢出濃度逐年遞增⁰。OPFRs具有多種同系物，其 中磷酸三（2-氯丙基）醋（tris (2~chloroisopropyl) phosphate, TCPP)是目前zui常見(jiàn)的有機(jī)磷阻燃劑，而 且在我國(guó)環(huán)境中廣泛存在^H。近年來(lái)，大量研究證 實(shí)OPFRs具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、內(nèi)分泌干擾效 應(yīng)、發(fā)育毒性、致癌性^a ,其中以神經(jīng)毒性及甲狀腺 干擾效應(yīng)zui為顯著^[4-5。TCPP作為可疑的甲狀腺 激素干擾物（TDCs),可能會(huì)對(duì)甲狀腺激素產(chǎn)生干擾 效應(yīng)⁰。甲狀腺激素功能的紊亂，會(huì)影響神經(jīng)及大 腦的發(fā)育。因此，本研究以TCPP為受試物，通過(guò)對(duì) KM小鼠灌胃染毒，探索TCPP暴露對(duì)KM小鼠學(xué)習(xí) 記憶能力及其血清甲狀腺激素水平的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)4周齡KM小鼠，由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物中心提供SCXK (桂）2013-0001], 60只，雌雄 各半，體質(zhì)量（26.6 ±4) g。小鼠飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué) 院公共衛(wèi)生學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物房SYXK (桂）2013- 0001],自由采食和飲水，室內(nèi)溫度20癈 ~ 25°C,濕 度40% ~ 70%, 12 h亮暗循環(huán)。本研究獲得桂林醫(yī) 學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（GLMC: 201710020)。小鼠的飼養(yǎng)及使用過(guò)程嚴(yán)格遵守《美 國(guó)公共衛(wèi)生署人道管理和使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物政策》^[7。

KM小鼠在實(shí)驗(yàn)中處于舒適的環(huán)境，并為其提供足 夠的水和食物，舒適的睡眠，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則對(duì)其給予人道的關(guān)懷。

1.2主要儀器

Morris水迷宮檢測(cè)系統(tǒng)，產(chǎn)品型號(hào)XR- XM101 (上海欣軟信息科技公司）。

3討論

OPFRs是由磷酸根骨架及三個(gè)取代基組成，根 據(jù)取代基的種類(lèi)，可以分為烷基OPFRs、芳基 OPFRs、鹵代（主要是氯）烷基OPFRs三種。鹵代烷 基OPFRs中又分為TCPP (磷酸三（2-氯丙基）酯）、 冗瓦？（磷酸三氯乙酯）、丁0匸？？（磷酸三（2,3-二氯 丙基）酯）、TDCIPP (磷酸三（1,3-二氯-2-丙基）酯）。 TCPP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與 TCEP、TDCPP、TDCPP、TDCIPP 相似，均是氯化OPFRs,可以在環(huán)境中長(zhǎng)期存在。 TCPP是目前數(shù)量多運(yùn)用zui廣的氯化OPFRs,可 能對(duì)環(huán)境生物和人體帶來(lái)巨大危害。目前，大量研 究集中在TCPP對(duì)環(huán)境生物的影響。有研究表明, TCPP通過(guò)干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)來(lái)影響斑馬魚(yú)的發(fā) 育^¹。TCPP暴露會(huì)導(dǎo)致秀麗線(xiàn)蟲(chóng)生殖發(fā)育障礙、 運(yùn)動(dòng)行為損傷和神經(jīng)毒性等^M。通過(guò)大鼠垂體瘤 細(xì)胞（GH3)增殖實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TCPP對(duì)甲狀腺激素具 有干擾效應(yīng)⁶³。

然而TCPP對(duì)晡乳動(dòng)物的毒性研究很少。本研 究發(fā)現(xiàn),高劑量TCPP (100 mgKkg*d))灌胃后小鼠 飲水量出現(xiàn)降低，肝和脾臟器指數(shù)出現(xiàn)顯著升高。 這一現(xiàn)象，與其同系物TDCIPP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果十分相 似。Zhao 等⁶¹² 用 TDCIPP (100 mgKkg.d)、250 mg^kg*d))灌胃青春期雌性大鼠21 d,也出現(xiàn)肝臟 器指數(shù)、（肝、腎臟器指數(shù)）的增加。

TDCIPP(150 mgKkg-d))灌胃大鼠也出現(xiàn)了母鼠 肝質(zhì)量的增加。這些結(jié)果說(shuō)明，高劑量的TCPP暴 露會(huì)對(duì)小鼠的生長(zhǎng)和發(fā)育帶來(lái)不利的影響。但是 皮天星等^M用TCPP對(duì)成熟斑馬魚(yú)進(jìn)行染毒，發(fā)現(xiàn) 肝指數(shù)隨著濃度的增加而降低。

TCPP等多種OPFRs(22 ng/g)染毒鳥(niǎo)類(lèi)21 d,并未 觀(guān)察鳥(niǎo)類(lèi)肝出現(xiàn)氧化損傷，但是肝細(xì)胞的完整性和功能性發(fā)生適度的改變。以上結(jié)果的不同，可能是 因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類(lèi)和劑量、染毒方式的不同所致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒組小鼠逃避潛 伏期和游行總路程出現(xiàn)明顯延長(zhǎng)，在第三象限停留 時(shí)間出現(xiàn)下降，說(shuō)明TCPP暴露后小鼠的學(xué)習(xí)、記憶 能力出現(xiàn)明顯下降。這一結(jié)果說(shuō)明，TCPP和其他 氯化OPFRs -樣，具有明顯的神經(jīng)毒性。Tilson 等M用Tcep急性短期（275 mg/kg)灌胃雌性大 鼠，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中也出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力受損。 這些結(jié)果與海馬椎體細(xì)胞大量減少有著密切的關(guān) 聯(lián)。Umezu等^M用TCEP急性短期（200 mg/kg)灌 胃小鼠，小鼠自發(fā)性走動(dòng)活動(dòng)增加。這個(gè)結(jié)果可能 是TCEP拮抗神經(jīng)遞質(zhì)₇省基丁酸（GABA)有關(guān)。 由于有機(jī)磷酸酯類(lèi)阻燃劑在結(jié)構(gòu)上有與有機(jī)磷農(nóng) 藥類(lèi)似的磷酸二酯鍵,也有研究認(rèn)為OPFRs可能通 過(guò)抑制膽堿酯酶產(chǎn)生神經(jīng)毒性⁶¹⁶。但是對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)進(jìn) 行TCEP或TCPP染毒會(huì)導(dǎo)致線(xiàn)蟲(chóng)自主運(yùn)動(dòng)缺陷、 帕金森樣運(yùn)動(dòng)障礙，引起多巴胺能神經(jīng)元退化。 TDCIPP對(duì)大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞（PC12)染毒時(shí),導(dǎo) 致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而激活絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信號(hào)通路¹³。上述研究雖然提出了研究 OPFRs的神經(jīng)毒性機(jī)制的新方向，但多為體外或脊 椎動(dòng)物,還需要進(jìn)一步在體內(nèi)和其他物種特別是晡 乳動(dòng)物中進(jìn)一步探討。

甲狀腺激素在人類(lèi)和動(dòng)物的生理過(guò)程中起到 了重要作用，尤其是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分化、發(fā)育 及各種功能形成過(guò)程中。因此，干擾甲狀腺激素將 會(huì)對(duì)正常生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)。由于TCPP 的化學(xué)結(jié)構(gòu)與TT3和TT4結(jié)構(gòu)相似，因此TCPP可 能對(duì)甲狀腺素產(chǎn)生干擾效應(yīng),故被列為可疑甲狀腺 激素干擾物（TDCs)。流行病學(xué)研究顯示，室內(nèi)粉塵 中TDCIPP的含量與人體血清中FT4有著密切的關(guān) 系，二者出現(xiàn)負(fù)相關(guān)^M。本次研究發(fā)現(xiàn)，高劑量 TCPP染毒組小鼠與對(duì)照組小鼠相比TT3、FT3出現(xiàn) 明顯增高。同為氯代有機(jī)磷阻燃劑的TDCIPP對(duì)大 鼠染毒，也出現(xiàn)了 TT3增高的結(jié)論^M。但是 TDCIPP對(duì)雞胚、斑馬魚(yú)染毒，均出現(xiàn)了 TT4減少的 現(xiàn)象^⁹ — ²⁰,而本研究TT4未出現(xiàn)明顯改變。以上 結(jié)論出現(xiàn)不同的原因，可能是因?yàn)椋鄬?duì)于其他物 種，晡乳動(dòng)物具有更好的免疫力和強(qiáng)大的自我調(diào)節(jié) 機(jī)制。當(dāng)外界環(huán)境出現(xiàn)改變時(shí)，機(jī)體內(nèi)甲狀腺激素 (thyroid hormones, TH)水平會(huì)受到干擾。晡乳動(dòng)物 往往比卵生動(dòng)物更快的啟動(dòng)調(diào)節(jié)機(jī)制，如腦垂體和 下丘腦的負(fù)反饋調(diào)節(jié)及甲狀腺代償機(jī)制來(lái)維持甲 狀腺激素的穩(wěn)態(tài)。而且，卵生動(dòng)物與晡乳動(dòng)物有著 不同的吸收、分布、代謝、排出的過(guò)程。卵生動(dòng)物免 疫功能及外界環(huán)境抗干擾能力顯著低于晡乳動(dòng)物, 所以卵生動(dòng)物比晡乳動(dòng)物更加敏感。本研究發(fā)現(xiàn)
高劑量染毒導(dǎo)致甲狀腺激素增高，可能是機(jī)體的補(bǔ) 償機(jī)制。同為阻燃劑的多溴聯(lián)苯醚，也出現(xiàn)了類(lèi)似 的效應(yīng)。而且，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)甲狀腺激素的變化水 平，往往比單個(gè)時(shí)間點(diǎn)甲狀腺激素水平更有意義。 但是，由于本研究經(jīng)費(fèi)有限，因此沒(méi)有進(jìn)行多點(diǎn) 檢測(cè)。

大腦是機(jī)體代謝旺盛的器官，其抗氧化能力 比較弱。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量tcpp暴露均可導(dǎo)致 小鼠腦組織中MDA水平升高（P< 0. 05), GST和 SOD活力下降（P< 0. 05),以及小鼠的學(xué)習(xí)、記憶能 力出現(xiàn)明顯下降。說(shuō)明氧化應(yīng)激在TCPP的神經(jīng)毒 性中起到重要作用。有研究報(bào)道，較高濃度TCPP (100、150、200 pm〇l/L)對(duì)人肝癌細(xì)胞（HepG2)、人 肺腺癌細(xì)胞（A549)、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞（Caco-2)細(xì)胞 染毒時(shí)，相關(guān)細(xì)胞活力將受到抑制，其原因是細(xì)胞 內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧、誘導(dǎo)DNA損傷及乳酸脫氫酶 (LDH)大量滲出⁰²¹。此外其同系物TDCIPP(30、 60 pm〇l/L)對(duì)PC12細(xì)胞染毒時(shí)，細(xì)胞內(nèi)活性氧增 多,SOD與GSH隨之劑量增高而降低，而MDA呈現(xiàn) 增高的趨勢(shì)¹²²。以上研究與本研究結(jié)果比較一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量TCPP染毒導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生 神經(jīng)毒性及血清中TT3、FT3出現(xiàn)明顯增高。甲狀 腺激素水平的增高，可以介導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo) 致腦細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和腦細(xì)胞損傷的發(fā)生，終導(dǎo) 致學(xué)習(xí)記憶能力下降^M。綜上，TCPP暴露具有明 顯的神經(jīng)毒性,其毒性機(jī)制可能與腦組織氧化損傷 及甲狀腺激素紊亂有關(guān)。