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淺析動物刺激誘發痛行為學檢測實驗方法(1)
點擊次數:2103 更新時間:2021-06-08

疼痛研究的最終目的是尋找有效鎮痛手段。目前臨床治療方法不能充分控制頑固性疼痛,主要歸 結于疼痛的機制仍不十分清楚,對實驗室動物痛行為學進行研究有助于揭示疼痛的相關機制。經典刺激誘發 痛行為學檢測,如 von Frey 痛閾實驗、甩尾實驗、熱板實驗、哈格里夫斯實驗等,已用于大鼠和小鼠動物研究多 年,且在檢測鎮痛效果方面存在一定的缺陷和不足,急需新的可靠的行為學檢測助力痛覺機制研究和鎮痛策略 研發。本文對動物痛行為學檢測的最新研究進展進行綜述,重點介紹了 8 種檢測方法: 鬼臉量表、自主行為、轉 輪跑步行為、挖洞行為、筑巢行為、家庭籠監控、步態分析以及條件性位置偏愛/厭惡。每種檢測方法均給出其優缺點,以幫助研究者選擇最合適的行為學檢測方法。

1、經典刺激誘發痛行為學檢測的局限性

以大鼠和小鼠為研究對象的痛行為學檢測已有上百年 歷史,最早可追溯到 1869 年即 150 年前的 von Frey 痛閾實驗。罪常用的還有 1941 年的甩尾實驗( tail flick)、1975年熱板實驗( hotplate) 和 1988 年的哈格里夫斯實驗( Har- greaves tests)。這 4 種經典的刺激誘發痛行為學檢測實驗,其原理均是給予大鼠和小鼠等小動物急性傷害性刺激( noxious stimulation) ,然后觀察動物的行為學反應,包括縮足或甩尾潛伏期、機械性刺激或溫度刺激閾值等,從而評估動物是否出現觸誘發痛( 即正常機械性刺激引起的痛覺,allo-dynia) 、機械性痛敏( 即機械性痛閾降低,mechanical hyperal- gesia) 以及熱痛敏( thermal hyperalgesia) 。

 

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雖然 4 種經典刺激誘發痛行為學檢測已用于大鼠和小鼠動物研究多年,但是其局限性較明顯: 第一,理想的鎮痛藥物應該在保留完整痛誘發反應的基礎上特異性減輕病理性痛癥狀,即只減少病理性疼痛,不阻礙對有害刺激的正常反應,以保證患者服藥后能在生活中避免受到傷害。但是,4 種經典實驗所檢測的均為實驗動物對急性傷害性刺激后的行為學反應。因此,當觀察到藥物具有鎮痛( analgesic) 效應時,其實意味著這些"鎮痛" 藥物可能阻斷的是動物的正常保護性痛行為學反應。這也就可以解釋,當這種藥物應用于臨床患者時,由于藥物阻斷了人體正常保護性痛反應,故導致患者出現腳趾觸到燙的火爐甚至被燙出水泡時仍然不知道自我保護的情況。第二,當實驗動物對痛刺激不反應時,除鎮痛效果外,還可能有 4 種原因: 驚恐的情緒、運動動力缺乏( lack of motivation) 、麻痹運障礙、藥物鎮靜作用 ( seda- tion) 。

                                    足底機械痛測試儀,型號:XR-XZD,上海欣軟

 

由此可見,僅用痛誘發反應進行動物痛行為學檢測具有很大缺陷與不足,急需可靠的行為學檢測助力痛覺機制研究和鎮痛策略研發。

2、8 種痛行為學檢測方法的原理及優缺點

本文主要對動物痛行為學檢測方法的最新研究進展做以介紹,重點介紹了 8 種痛行為學檢測: 鬼臉量表( grimacescale) 、自 主 行 為( operant behavior) 、轉 輪 跑 步 行 為 ( wheel running) 、挖洞行為( burrowing) 、筑巢行為( nesting) 、家庭籠監控( home cage monitoring) 、步態分析( gait analysis) 以及條件性位置偏愛/厭惡( conditioned place preference / aversion) 。每種檢測方法均給出其優缺點,以幫助研究者選擇最合適的 行為學檢測方法。

2.1 鬼臉量表

痛苦表情被認為是人類和動物共同的表達痛苦的方式,當大鼠和小鼠遭受疼痛時會出現面部表情改變,通過對痛苦表情的評判與量化以區分痛與不痛,并對疼痛的級別給予量化。需要注意的是,判定由疼痛導致的表情改變必須同時滿足存在疼痛情境的條件。鬼臉量表的使用方法多 采用視頻捕獲動物面部表情。表情改變主要包括: ① 面部眼眶收緊; ② 耳廓伸展變為扁平; ③ 面部腫脹; ④ 鼻根腫脹。由輕到重評分為 0 ~ 2 三檔,其中 0 為不存在,2 為醉明顯。

由于該方法不會阻斷正常保護性痛反應,因此可以用來區分動物驚恐的情緒、運動動力缺乏、麻痹運動障礙、鎮靜等。而且方法簡單,只需攝像機和圖像捕獲軟件即可,不需專門設備; 此外實驗動物不需接受專門訓練,在飼養籠里即可評估。但該方法也存在 3 個主要的缺陷,第一,疼痛持續時間與面部表情不匹配。例如,后足炎癥可產生兩周以上觸誘發痛,但鬼臉量表評分在 2 ~ 7 d 便恢復到基線水平。此時動物雖然沒有痛苦表情,但是并不意味沒有經受痛苦,只是疼痛不再引起表情變化。因此,鬼臉量表僅適用于shen經病理性痛的早期階段。第二,只有顯著疼痛才能得出統計學差異。第三,8% 的無痛大鼠也可見痛面部表情特征。

2.2 自主行為

人類和動物在感覺疼痛時均會發生自主行為的減少。人類表現為鍛煉、工作或社交行為減少,而動物表現為攝食減少。由此可通過對攝食是否減少以及對減少程度的評判以區分痛與不痛,并實現對疼痛級別的量化。自主行為檢測疼痛有一個重要的特點,即該方法在鎮痛藥物篩選上具有顯著優勢,這是因為鎮痛藥物不影響攝食,而鎮靜藥物則可顯著減少攝食,所以自主行為檢測疼痛時保留了動物正常保護性痛反應,預防了疼痛對動物的過度傷害。

但是該方法也存在局限性,目前研究幾乎全部基于顱內自主刺激( intracranial self-stimulation,ICSS) ,即將刺激電極植入大鼠內側前腦束,再結合獎賞機制訓練大鼠通過按壓桿進行自我腦刺激,當大鼠反應穩定時,立即給予動物一個傷害性刺激,然后觀察大鼠的攝食行為變化。所以開展此項研究者需配置 ICSS 實驗室,沒有該實驗室則該方法不適用。此外,自主行為檢測時不能區分驚恐情緒、運動動力缺乏、麻痹運動障礙、鎮靜等行為,這是它的另一個缺點。

2.3 轉輪跑步行為

轉輪跑步行為是嚙齒動物的一種本能,而當動物出現后足炎癥、關節炎、偏頭痛樣疼痛、shen經病理性痛以及術后痛時,該行為表現為明顯減少。由此通過對轉輪跑步行為減少程度的評判可衡量藥物的鎮痛效應。該方法以車輪轉數和跑步時間作為觀察指標為,保證了數據的客觀性,而且在飼養籠中即可進行跑步,排除了環境變化帶來的影響。此外,有研究發現,低劑量嗎啡( 1 mg /kg,此時發揮的是鎮痛效應) 緩解大鼠炎性痛的同時可恢復其跑步行為,而高劑量嗎啡( > 3 mg /kg,此時發揮的是鎮痛和鎮靜的綜合效應) 在鎮痛同時抑制跑步行為。因此,轉輪跑步行為檢測可在保留正常痛反應的前提下,篩選出臨床有效的鎮痛藥物。

但是,若使用該方法檢測疼痛,動物需要至少一周訓練才能保證結果較為穩定,而且不能從結果中甄別出由于動機缺乏而導致的行為減少情況。另外,轉輪跑步行為本身具有幫助動物從疼痛中恢復的作用,所以,不適用于長時程期進行檢測。                            大小鼠轉輪,型號:XR-PL107,上海欣軟

2.4 挖洞與筑巢行為

挖洞行為與筑巢行為是嚙齒動物的本能自發行為,當動物出現病理性痛后,以上兩種行為明顯減少,目前這一特性已被廣泛應用于實驗研究中。其中,挖洞行為檢測時需要預先在籠內管道中放入一定量墊料,通過測量動物從管道中取出墊料的時間和數量來評估動物的疼痛等級。筑巢行為則是通過測量動物筑巢時間和巢穴質量評估動物疼痛等級。這兩種方法在飼養籠即可進行,避免了環境變化帶來的影響。另外,雖然兩種行為多發生于夜晚,但觀察者可以在白天觀察結果,還可反復放入挖洞與筑巢行為所需材料,并進行多次測試。以上優點使得該方法簡便易行。此外,挖洞行為與筑巢行為保留了動物正常痛行為反應,這是其最大的優勢所在。

然而,記憶等高級腦功能異常可導致筑巢和挖洞行為減少,因此該檢測不能對此進行甄別。對于埃及多刺小鼠( Egypt spiny mice) 等無自然筑巢行為的物種[28],該方法也不適用。此外,該檢測方法還受多種因素影響,例如寒冷環境中群居雌鼠的筑巢行為比獨居鼠更高,因此對溫度等檢測條件應盡可能嚴格設定。

下一篇我們將繼續分析homecage(家庭籠監控)步態分析儀(VisuGait動物步態分析系統,型號:XR-FP101)、條件性位置偏愛/厭惡以及用蔗糖偏愛和超聲波發聲進行疼痛行為學評估的實驗介紹。

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