具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）基序的轉(zhuǎn)錄因子（TF）通過(guò)激活或抑制不同靶基因的表達(dá)，在神經(jīng)祖細(xì)胞（NPC）向神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的命運(yùn)決定中發(fā)揮重要作用。神經(jīng)元PAS結(jié)構(gòu)域蛋白3（NPAS3）屬于TFs的bHLH PAS超家族，研究表明，攜帶bHLH結(jié)構(gòu)域缺失的NPAS3缺陷小鼠顯示成年海馬神經(jīng)發(fā)生和認(rèn)知行為缺陷。星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙通過(guò)影響鄰近神經(jīng)元功能而誘發(fā)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，在皮質(zhì)發(fā)育過(guò)程中星形膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元通信如何調(diào)節(jié)復(fù)雜行為仍然未知，且調(diào)節(jié)NPC向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化的bHLH因子也未被研究。

2022年，8月30日，中科院北京生命科學(xué)學(xué)院孫中生與王彥課題組在cell reports上發(fā)文揭示bHLH因子（NPAS3）缺陷將損害皮質(zhì)星形細(xì)胞生成并誘導(dǎo)自閉癥樣行為。

首先，課題組通過(guò)免疫染色發(fā)現(xiàn)Npas3缺陷導(dǎo)致小鼠發(fā)育過(guò)程中皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞生成減少。而對(duì)成年鼠的大腦評(píng)估顯示：Npas3+/-鼠的大腦重量和寬度及皮質(zhì)長(zhǎng)度顯著增加，表現(xiàn)出大頭畸形。結(jié)構(gòu)性磁共振結(jié)果顯示Npas3+/-鼠的腦脊液、扣帶皮層、胼胝體和藍(lán)斑區(qū)域體積顯著增加；此外，體素分析結(jié)果顯示其腦脊液體積增加，而由星形膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的白質(zhì)體積減少。

圖1|Npas3+/-鼠腦部結(jié)構(gòu)異常

隨后，課題組對(duì)兩組小鼠進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，結(jié)果顯示：Npas3+/-鼠在社交測(cè)試階段對(duì)物體和陌生鼠的探索時(shí)間沒(méi)有差異，在社交新穎性測(cè)試階段對(duì)陌生鼠和熟悉鼠的探索時(shí)間沒(méi)有差異，即表現(xiàn)出社交及社交新穎性缺陷；而在超聲波發(fā)聲實(shí)驗(yàn)中，Npas3+/-幼崽在P7（出生后7天）和P13與母鼠分離時(shí)發(fā)出的呼叫較少，呼叫持續(xù)時(shí)間較短；此外，Npas3+/-的自我梳理時(shí)間也顯著增加，表現(xiàn)出焦慮樣表型。這些結(jié)果表明Npas3缺陷導(dǎo)致小鼠產(chǎn)生ASD樣行為。

圖2|小鼠行為學(xué)測(cè)試結(jié)果

為了確定NPAS3在星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生初期誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化，課題組在P0期對(duì)WT和NPAS3+/-小鼠皮層進(jìn)行了RNA測(cè)序，并發(fā)現(xiàn)與膠質(zhì)細(xì)胞生成和突觸調(diào)控有關(guān)的基因表達(dá)水平下調(diào)；高爾基染色結(jié)果顯示Npas3+/-皮質(zhì)II/III層錐體神經(jīng)元基底樹突棘密度顯著降低，而透射電鏡的結(jié)果顯示Npas3+/-小鼠皮層中突觸后致密區(qū)PSD）的不對(duì)稱突觸的數(shù)量顯著減少，其PSD長(zhǎng)度也顯著減少。體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示：NPAS3缺陷的星形膠質(zhì)細(xì)胞將減少與之共培養(yǎng)的神經(jīng)元數(shù)量。這些結(jié)果表明星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常發(fā)生影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞-突觸的相互作用。

圖3| 體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

進(jìn)一步的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，Npas3缺陷將擾亂小鼠腦中放射狀膠質(zhì)細(xì)胞到星形膠質(zhì)細(xì)胞的正常分化，從而顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的生成。ChIP測(cè)序數(shù)據(jù)的分析表明NPAS3 的結(jié)合靶點(diǎn)廣泛覆蓋了星形膠質(zhì)細(xì)胞形成的各個(gè)過(guò)程，并涉及大腦發(fā)育、樹突發(fā)育和突觸形成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。最后，課題組采用化學(xué)遺傳的方法在WT鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞中特異性敲低NPAS3，發(fā)現(xiàn)這些小鼠同樣表現(xiàn)出自閉癥樣相關(guān)的形態(tài)和行為異常。

圖4|NPAS3影響樹突發(fā)育和星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)突觸形成的控制

總的來(lái)說(shuō)，該文發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子——NPAS3調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞分化以及星形膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元通訊過(guò)程，且NPAS3缺陷會(huì)導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞生成異常并引發(fā)自閉癥樣行為。這項(xiàng)研究為bHLH轉(zhuǎn)錄因子在星形膠質(zhì)細(xì)胞生成中的缺陷如何影響皮質(zhì)發(fā)育和復(fù)雜行為的機(jī)制提供了見(jiàn)解。